B027328 - IMAGING MORFO-FUNZIONALE AVANZATO

Microscopia e principi ottici. Fluorescenza. Rivelatori. Analisi di immagini. Metodi avanzati di contrasto. Super-risoluzione e SPIM. Trappole ottiche, ablazione laser. Microscopia elettronica. Imaging volumetrico del SNC. Coloranti organici, nanoparticelle e quantum dots. Composti caged. Proteine fluorescenti e loro varianti; metodi di transgenesi. Misura ottica del calcio per l’imaging funzionale del tessuto nervoso. Optogenetica e metodi per l’interrogazione dei circuiti neuronali.

Il corso fornirà le conoscenze di base dell'ottica per comprendere il funzionamento dei più importanti tipi di microscopio utilizzati in biologia (per esempio campo largo, confocale, TIRF, due fotoni, SPIM) e di spettroscopia (per esempio fluorescenza, FRET, generazione di seconda armonica) per comprendere i vari meccanismi di contrasto.
Verranno inoltre illustrati i principi della microscopia elettronica e i più recenti sviluppi applicati alla microscopia correlativa e alla ricostruzione ultrastrutturale tridimensionale (FIB/SEM).

Verranno quindi trattati i metodi di preparazione e marcatura di cellule, tessuti e per lo studio in vivo, illustrando le metodiche e i composti disponibili per la marcatura di cellule fissate e viventi, per la marcatura selettiva di organuli e la misura dinamica di parametri cellulari quali pH, calcio, forze intracellulari, potenziale di membrana...

Si discuteranno in particolare le proteine fluorescenti, le loro caratteristiche e tutti i loro derivati, utilizzabili in marcature a più colori, con specificità molecolare e per l'imaging funzionale, per esempio dell'attività neuronale.

LA MICROSCOPIA OTTICA
Principi di ottica geometrica, rifrazione, lenti, focale e ingrandimento. Limite diffrattivo: point-spread function e risoluzione. Aberrazioni.
Le componenti ottiche di un microscopio. Caratteristiche degli obiettivi. Microscopi con ottiche corrette all’infinito. Campo visivo e profondità di campo.
Modalità di illuminazione: sistemi in campo largo, scansione, riflessione interna totale. Metodi di contrasto: campo oscuro, contrasto di fase, polarizzazione, fluorescenza. Le caratteristiche della fluorescenza, spettri di assorbimento ed emissione, Stoke’s shift, fosforescenza e photobleaching. Metodi per la riduzione del photobleaching e della fototossicità per il campione. Eccitazione ad uno e due fotoni. Il microscopio in epifluorescenza: filtri, specchi dicroici e la loro scelta. Il microscopio confocale. Il microscopio SPIM.
I rivelatori: CCD, EMCCD, sCMOS, fotodiodi a valanga, tubi fotomoltiplicatori. Sorgenti di rumore: background, read-out noise. Integrazione, velocità di scansione e frame rate, risoluzione temporale di un sistema di imaging. Il campionamento spaziale di un’immagine, dimensioni del pixel, ingrandimento e criterio di Nyquist. Profondità dell’immagine, contrasto, range dinamico e saturazione.
Analisi dell’immagine e deconvoluzione, analisi multispettrale e linear unmixing, localizzazione e tracking.
Metodi avanzati di contrasto e misura: FRET, FRAP, FLIP, FLIM, FCS, FSM, SHG, fluorescenza di singola molecola. La microscopia in super-risoluzione: PALM, STORM, STED; RESOLFT, 4Pi e PSF isotropica.
Metodi per la manipolazione di campioni: trappole ottiche, ablazione laser e nanodissezione.
Microscopia elettronica in trasmissione e scansione, microscopia correlativa e ricostruzione ultrastrutturale in 3D. Dual-beam FIB/SEM e sue applicazioni biologiche.

I METODI PER LA MARCATURA E LO STUDIO MORFO-FUINZIONALE DEI CAMPIONI BIOLOGICI
La microscopia in vivo e su campioni fissati. Metodi di fissazione. La chiarificazione di campioni per applicazioni avanzate di istologia 3D e citoarchitettonica su larga scala del sistema nervoso centrale.
I coloranti organici e la chimica di base delle coniugazioni con molecole biologiche. Nanoparticelle e quantum dots. Crosslinkers. Composti caged per lo studio di processi dinamici. La marcatura con anticorpi, avidine e lectine. La marcatura di proteine, acidi nucleici, lipidi e carboidrati.
Le proteine fluorescenti e le loro varianti: caratteristiche spettrali, folding, stato di oligomerizzazione. La permutazione circolare, le split-GFP e test BIFC. I principali metodi di transgenesi per la produzione di modelli animali esprimenti proteine fluorescenti.
La misura ottica delle proprietà chimico-fisiche nella cellula e delle loro dinamiche: rivelatori di forze meccaniche, pH, ossigeno e sue specie reattive, del potenziale di membrana, di ioni. La misura ottica del calcio per l’imaging funzionale del tessuto nervoso.
Misure ottiche di attività nella cellula: la rivelazione di attività enzimatiche e i test di vitalità e proliferazione.
La marcatura di organuli e delle loro dinamiche.
Il controllo ottico dell’attività neuronale: optogenetica. Metodi per l’interrogazione dei circuiti neuronali.